ASH消减cDNA文库


ASH消减cDNA文库是一种基于APA、全长富集的、单链cDNA消减杂交文库。我们还可以提供一个反向消减cDNA文库。

ASH消减cDNA文库的特点

★  ASH消减文库平均插入片段的大小约为1200bp。
★  ASH消减文库克隆数量多,cDNA消减文库的总克隆数量大约为30,000个,当然客户如果有需求我们也可额外增加克隆的数量。
★  ASH消减文库中的cDNA为全长富集。
★  ASH消减文库中的cDNA均为定向克隆,我们将使用pBluescript定向克隆载体对文库进行定向修饰,即5'端/ EcoRI内切酶和3'端/ XhoI内切酶。

★  ASH消减文库既不阵列也不扩增,提供转化的细胞。

ASH消减cDNA文库构建步骤

1、总RNA的提取和纯化;
2、反义链合成与测试(全长富集);
3、通过APATM(全长富集)法合成和标记有义链;
4、以> 500:1的比例进行(驱动剂:测试器)杂交;
5、去除双链杂交体;
6、剩余单链cDNA的PCR扩增与测试;
7、纯化和酶消化,连接和沉淀;
8、PCR测试克隆大小和重组效率;

9、转化细胞将在干冰上运输,如需阵列尽量在收到细胞的后3天内完成并于-80度保存。

Figure 1: ASH cDNA - Actin gene reduction in grapefruit.(Tested and driver cDNA was prepared from grapefruit citrus leaves. PCR was performed on the unsubtracted cDNA (lanes 1-4) and subtracted cDNA (lanes 5-8) using the actin gene. Note the important reduction of the abundant actin gene.)


ASH消减技术相对于SSH消减技术的优势

1、ASH cDNA消减法不需要均一化步骤 (自我消减)。SSh法需要均一化步骤,这样会导致差异         性表达基因的自我消减 从而导致表达偏差。
2、ASH cDNA消减法对长cDNA(一般>1.2kb)是有效的,cDNA都是全长富集的,并且不受PCR        限制。SSH法要求的都是缩减后的cDNA(一般<700bp)且受PCR限制,这样会降低消减效            果。 并且SSH法对长cDNA是没有效果的。
3、ASH cDNA消减法在消减之前会提供非指数扩增,因为不需要双链cDNA。SSH法在杂交之前通        常需要进行PCR扩增步骤。这就会导致在消减步骤之前的表达偏差,从而降低消减效果。
4、ASH cDNA克隆是定向的,并且可以用于构建表达文库。SSH克隆是非定向的,无法进行定向功      能筛选。